2019年 8月2 日，清华大学医学院生物医学工程系、清华-北大生命科学联合中心杜亚楠研究组于Nature Communications 《自然？通讯》在线发表了题为“Cryoprotectant enables structural control of porous scaffolds for exploration of cellular mechano-responsiveness in 3D”的研究论文。该研究首次利用冰冻保护剂，对3D多孔生物支架材料的孔径和硬度实现了独立和精确的调控，并系统探究了成纤维细胞和巨噬细胞对于材料孔径和硬度的机械响应特征和相关机制，为基于仿生3D多孔支架材料中的生物力学和组织工程研究提供了有力工具，为精确控制细胞3D微环境的物理特性提供了理论和实施基础。
近年来生物力学领域的快速发展已证明生物基质材料的物理特性（如硬度）是构成细胞微环境的重要特性，对细胞表型和功能（如粘附、增殖、迁移、分化、遗传和表观遗传等）的调控至关重要。目前对于生物材料的生物力学研究局限于2D平面材料或仅具有纳米孔的3D水凝胶，尽管3D大孔生物支架材料在组织工程和再生医学中广泛应用，至今尚未能对其进行系统性的生物力学研究，这是由于大孔支架材料最主要的两个物理特性即支架的孔径和硬度通常相互关联，目前的制备手段（如静电纺丝、冷冻干燥、致孔剂）很难对两者进行独立调控以实现单一生物力学特性调控细胞行为的深入研究。
本研究中，杜亚楠教授课题组发现引入冰冻保护剂（如DMSO、甘油、甲醇）可对冰晶生长实现有效调控，并利用这一特性实现了对于多孔支架材料孔径与硬度的独立调控。研究者发现，在冷冻过程中，随着冰晶生长，反应液相中的DMSO被不断浓缩，导致液相凝固点逐渐降低最终致使冰晶停止生长。理论和实验数据均表明，最初反应液中的DMSO浓度可决定最终形成冰晶的大小。基于此原理，通过调控交联剂和冰冻保护剂的用量，可制备出源自各类原料组分（如明胶，透明质酸/明胶复合材料），孔径范围在20-80 μm，微观硬度范围在20-190kPa的可独立、精确调控孔径和硬度的3D多孔支架材料。
图1：使用冰冻保护剂控制冰晶生长，实现对硬度和孔径的独立、精确调控
本研究开发的此种简单易行的多孔支架制备方法，使得系统研究材料结构和硬度对细胞机械响应成为了可能。成纤维细胞和巨噬细胞是在生长发育、炎症反应、损伤修复等生理病理过程中发挥重要作用的两类细胞，其对于细胞外基质生物力学性质的响应对于病理研究及植入材料设计都具有重要意义。体外研究发现，人真皮成纤维细胞在大孔径-较高硬度（80μm, 190 kPa）的材料中呈现出更激活的状态（例如：高表达αSMA），且材料力学和结构性质通过影响转录因子YAP的定位来调控成纤维细胞机械响应。巨噬细胞通常可极化为促炎症反应的M1型细胞和促损伤修复的M2型细胞。研究发现小鼠骨髓来源巨噬细胞在小孔径-较低硬度 (30 μm, 20 kPa)的材料中，倾向于极化为M1表型。相反，在大孔径-高硬度材料中，巨噬细胞呈现M2型特征。相应的，在小鼠体内皮下植入试验中，植入小孔径-低硬度材料，会诱导更多炎性细胞如M1型巨噬细胞及中性粒细胞浸润，呈现出显著的促炎效果；在小鼠体内皮肤修复模型中，植入大孔径-高硬度材料对于皮肤修复愈合速度和纤维化的促进作用最明显，表明对于损伤修复的促进效果。
图2：a.体外试验巨噬细胞在小孔径低硬度材料中呈现促炎激活表型。b.体内皮肤损伤修复模型中，浸润的巨噬细胞在小孔径低硬度材料中呈现促炎激活表型
研究团队进一步探索了多孔支架材料孔径对细胞表型调控的潜在机制。发现可通过调控培养液渗透压大小模拟不同孔径对细胞产生的空间物理限制。在高渗环境下，普通2D培养和3D大孔径培养的成纤维细胞和巨噬细胞都呈现出在3D小孔材料中的表型。表明材料孔径对细胞的机械调控和由孔径产生的物理限制 (physical confinement）有关。
本研究首次使用冰冻保护剂调控冰晶生长，从而在多孔生物支架材料中实现了孔径和硬度的独立、精确调节。体外和体内实验都验证了多孔支架孔径和硬度对于细胞机械响应的调控。以上研究结果为3D多孔生物支架材料的生物力学研究提供了有效平台，同时对调控3D细胞微环境的物理特性和对于其在组织工程领域中的临床应用提供了新的设计思路。
清华大学医学院、清华-北大生命科学联合中心杜亚楠研究员为本论文的通讯作者，杜亚楠研究组硕士研究生蒋书萌、博士研究生吕丞为本文共同第一作者。清华大学医学院石彦教授，夏铁副研究员在原子力显微镜力学表征方面提供了技术支持。美国华盛顿-圣路易斯大学机械工程系的Guy Genin教授在生物力学理论方面给与了支持，北京清华长庚医院皮肤科黄晨昱医师在皮肤修复方面给与了支持。该研究得到了清华大学实验动物中心、生物医学测试中心的支持。本研究得到了国家自然科学基金委优秀青年科学基金、国家重点研发计划的资金资助。
